Badania fizykochemiczne

● Stopień namoczenia ziarna zbadano poprzez umieszczenie próbki jęczmienia (200 g) o znanej wilgotności (11,75%) w ażurowym naczyniu i moczono (200 ml). Po określonym czasie moczenia (5 h i 12 h) próbka została zważona (po ocieknięciu wody), a następnie z otrzymanych mas obliczono stopień namoczenia według wzoru:

  gdzie,

M₁– masa pierwotna próbki, w kg
M₂ – masa próbki w chwili badania, w kg
W₂ –  zawartość wody w jęczmieniu, w %.

Rysunek 1. Badanie stopnia namoczenia ziarna 

● Oznaczenie energii kiełkowania jęczmienia wykonano metodą Schönfelda.

6 porcji jęczmienia umieszczono w lejkach, spływy zamknięto zaciskaczami, a ziarna zalano wodą. Lejek przykryto wilgotną bibułą i płytką Petriego. Po upływie 3 h zlano wodę pozostawiając ziarna na 18-20 h. Po tym czasie ponownie ziarna zalano wodą, a spływy lejków zamknięto zaciskaczami (na 2 h). Po upływie 72 h od początku oznaczenia policzono ziarna nieskiełkowane, które po raz kolejny przetrzymywano pod wodą w lejkach przez 30 min. Procedurę kiełkowania powtarzano do 120 h od rozpoczęcia oznaczenia i na koniec policzono ziarna nieskiełkowane [1].

● Wrażliwość ziarna na wodę oznaczono poprzez umieszczenie odpowiedniej porcji jęczmienia (100 ziaren) w szalkach Petriego, następnie ziarna zostały zalane wodą (4 i 8 ml). Po upływie 48 h policzono ziarna skiełkowane.

Rysunek 3. Wrażliwość ziarna na wodę

● Długość kiełka liścieniowego oznaczono poprzez umieszczenie 20 ziaren słodu w 100 mL kolbach stożkowych zawierających 40 mL 2% CuSO 4 . Tak przygotowane próby zostały przykryte i gotowane na gorącej płycie grzejnej przez 30 minut. Po tym czasie próby schłodzono, umieszczono w szalkach Petriego i dokładnie przeanalizowano pod kątem długości kiełka liścieniowego.

Rysunek 4. Długość kiełka liścieniowego – przebieg doświadczenia

● Wilgotność ziarna została zbadana poprzez ześrutowanie słodu na młynku laboratoryjnym (12 s.), odważeniu 4 g i umieszczeniu na wagosuszarce MAC 50 (EBC-Analytica 3.2 Moisture Content) [2].

Rysunek 5. Wagosuszarka RADWAG MAC 50

● Masa 1000 ziaren słodu została oznaczona odważając dwie porcje jęczmienia po ok. 40 g, po usunięciu ziaren uszkodzonych i ciał obcych określono liczbę ziaren w każdej porcji. Wynik obliczono na podstawie odpowiedniego wzoru [3].

Rysunek 6. Przygotowanie prób do obliczenia masy 1000 ziaren

● Celność ziaren i wyrównanie została przeanalizowana umieszczając próbę ziarna (100 g) odpowiednio na ramie sortownika z odpowiednio umieszczonymi sitami (2,2 mm, 2,5 mm, 2,8 mm). Sortownik przykryto i uruchomiono na czas 5 minut, po tym czasie wybrano z każdego sita zanieczyszczenia użyteczne i nieużyteczne i przeniesiono na dolną pokrywę. Frakcję oczyszczonego ziarna oraz pozostałość na dnie zważono oddzielnie [4].

Rysunek 7. Sortowanie ziarna na Sitach Vogla

● Ekstraktywność słodu zmierzono sporządzając brzeczki kongresowe metodą laboratoryjną zgodnie z metodyką EBC, w brzeczkach oznaczono ekstrakt i odpowiednio podstawiając do wzoru obliczono ekstraktywność wyprodukowanych słodów.

● Oznaczenie zawartości białka metodą Dumasa. Pobrano ok. 0,5 g badanego materiału, który umieszczono w foli cynowej. Folię zamknięto i umieszczono w głowicy ładującej. Następnie układ uszczelniono i odgazowano. Próbkę spalono w temperaturze 950°C w atmosferze czystego tlenu. Następnie produkty spalenia zostały skierowane do pieca wtórnego tzw. dopalacza (850°C), gdzie uległy końcowemu utlenieniu oraz zostały pozbawione zgrubnych zanieczyszczeń. Gazy powstałe w trakcie spalania gromadzone były wewnątrz zbiornika balastowego, gdzie uległy homogenizacji i mieszaniu z czystym helem. Taka mieszanka gazów przepuszczona została przez piec katalityczny wypełniony rozgrzaną miedzią, gdzie nastąpiła redukcja NO_x do N₂ oraz przez odczynniki Lecosorb i Anhydrone gdzie została oczyszczana z dwutlenku węgla i wody. Tak przygotowana mieszanka gazów trafiła do detektora termoprzewodnościowego, służącego do pomiaru zawartości azotu. Ilość azotu przeliczono następnie na zawartość białka [g/100g] mnożąc otrzymany wynik za pomocą przypisanych współczynników (6,25 i 5,7).

● Barwę brzeczki laboratoryjnej i piwa oznaczono poprzez dodatek 0,5 g/100 cm³ ziemi okrzemkowej, kolejno przefiltrowano przez bibułę filtracyjną. Następnie próby zostały przesączone przez filtr strzykawkowy z sączkiem o porach 0,45 μm i analizowane.

Urządzenia do pomiaru barwy:

• przy użyciu kuwety o grubości 25 mm w spektrofotometrze Shimadzu UV-1900.
• Przy użyciu kuwety o grubości 25 mm w kolorymetrze Lovibond® 

● pH brzeczki laboratoryjnej oraz piwa zmierzono poprzez bezpośredni pomiar przy użyciu pH-metru Mettler Toledo FiveGo. Urządzenie zostało wcześniej skalibrowane za pomocą odpowiednich roztworów buforowych [6].

Rysunek 9. pH metr Mettler Toledo FiveGo

● Ekstrakt brzeczki laboratoryjnej zmierzono poprzez bezpośredni pomiar za pomocą urządzenia Anton Paar Density Meter DMA 35.

Rysunek 10. Density Meter DMA 35

● Mętność brzeczki laboratoryjnej oraz piwa zmierzono bezpośrednio za pomocą Nefelometru Cyberscan TN 100, który jest przeznaczony do pomiaru mętności metodą nefelometryczną w zakresie 0-1000 NTU zgodnie z EN/ISO 7072.

Rysunek 11. Nefelometr Cyberscan TN 100

● Oznaczenie zawartości alkoholu, ekstraktu rzeczywistego i ekstraktu brzeczki podstawowej:

• Metodą destylacyjną
  Próbka piwa została odgazowana i przefiltrowana przez ziemię okrzemkową. Następnie odważono piwo do kolby okrągłodennej i dodano wodę destylowaną. Kolbę podłączono do zestawu destylacyjnego i destylowano do momentu, aż do odbieralnika przeszło 85 ml do 90 ml cieczy. PO skońćzeniu destylacji zawartość odbieralnika uzupełniono wodą destylowaną do 100,0 g z dokładnością do 0,1 g. Ciesz starannie wymieszano i oznaczono gęstość destylatu za pomocą piknometru. Zawartość alkoholu, ekstraktu rzeczywistego i ekstraktu brzeczki podstawowej obliczono według wzoru [7].

• Alcolyzer Anton Paar
  Oznaczenie przeprowadzono z wykorzystaniem urządzenia będącego miernikiem alkoholu i ekstraktu Alcolyzer Anton Paar. Przed oznaczeniem, próbki piwa odgazowano i przefiltrowano z ziemią okrzemkową przez sączek z bibuły filtracyjnej. Następnie do analizy pobrano 50 cm³ analizowanych piw.

Rysunek 12. Alcolyzer Anton Paar

● Oznaczenie zawartości wolnego azotu aminowego FAN (Free amino nitrogen).

Oznaczono poprzez odpowiedne dodanie do probówek: 2 cm³ rozcieńczonej próbki (1:50) brzeczki lub piwa, 2 cm³ wody (próba ślepa), 2 cm³ roztworu wzorcowego glicyny. Następnie do każdej probówki dodano 1 cm³ barwnika ninhydrynowego i umieszczono we wrzącej łaźni wodnej na dokładnie 16 min. Po tym czasie próby chłodzono przez 20 min. w łaźni wodnej o temperaturze 20∞C. Po tym czasie dodano 5 cm³ współczynnika do rozcieńczeń, wymieszano i w ciągu 30 min. zmierzono absorbancję przy długości fali 570 nm (spektrofotometr Shimadzu UV-1900), w odniesieniu do wody jako próby ślepej [8].

● Oznaczenie zawartości jonów wapnia, magnezu i cynku za pomocą atomowej spektrometrii absorpcyjnej (ASA).

• Mineralizacja. Przed analizą jonów metali, próbki brzeczki i piwa poddano mineralizacji w celu całkowitego rozkładu obecnych w nich substancji organicznych. Do naczynek mineralizacyjnych dodano odpowiednio 2 cm³ próbki, którą następnie zalano stężonym kwasem azotowym V (65%, 3 cm³). Tak przygotowane próbki poddano mineralizacji na mokro w piecu mikrofalowym Mars Xpress (temp. maks. 170 ∞C, czas 40 min.). Po jej zakończeniu zawartość naczynek mineralizacyjnych przeniesiono ilościowo do probówek i uzupełniono wodą dejonizowaną do objętości 14 cm³.

• Oznaczenie jonów metali. Analizę jonów magnezu, wapnia i cynku wykonano za pomocą spektrometru VARIAN 20FS wykorzystującego metodę absorpcyjnej spektrometrii atomowej z atomizacją płomieniową (powietrze/acetylen). Urządzenie wykorzystuje automatyczny system dozowania próbek SPIS-20. Absorbancję jonów Mg²⁺ określono przy długości fali 202,6 nm, Ca²⁺ – 422,7 nm, Zn²⁺ – 213,9 nm. Oznaczenia dokonywano w trybie Fast Sequential podczas jednej aspiracji próbki.

Rysunek 14. PIec mikrofalowy Mars Xpress

Rysunek 15. Spektrometr VARIAN 20FS

● Oznaczenie zawartości cukrów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Cukry fermentowalne zostały oznaczone zgodnie z metodą rekomendowaną Analytica-EBC 2.27 z nieznacznymi modyfikacjami przy zastosowaniu aparatu HPLC Dionex Ultimate -3000 wyposażonego w autosampler z prekondykcjonowaniem eluentu oraz kolumnę Aminex (HPX-87C, 300×7.8 mm) oraz  detektor refraktometryczny (Knauer, model 2400i). Warunki chromatograficzne były następujące: objętość iniekcji: 5 ul; faza ruchoma; woda dejonizowana (18 MOhm), prędkość przepływu 0.5 ml/min, termostatowanie 85°C, polaryzacja pozytywna (Breu, Guggenbichler, & Wollmann, 2008).

Do analiz wykorzystano chromatograf Ultimate 3000 (Dionex) kolumnę TSK-GEL GMPWXL, (7.8 mm ID x 30.0 cm); 10 µm (Tosoh Bioscience). Warunki operacyjne:

Typ elucji: izokratyczny, eluent: 200 mM bufor fosforanowo-sodowy pH 6.8, prędkość przepływu: 0.6 mL/min. termostat: 25°C, detekcja: UV-Vis 214/280 nm (Detektor PDA 3000 Dionex).

Rysunek 16. Przygotowanie prób

●  Oznaczenie zawartości związków lotnych za pomocą wysokosprawnej chromatografii gazowej (GC-MS).

Analizowane związki zostały oddzielone na kolumnie kapilarnej Restek Stabilwax (usieciowanie glikolem polietylenowym fazy stacjonarnej, 30 m x 0,25 mm ID o grubości 0,25 um). Temperatura detektora wynosiła 250°C, a temperatura kolumny podnoszona była za pomocą następującego programu temperaturowego: 35°C przez 5 minut przy wzroście temperatury od 5°C/min do 110°C, a następnie 40°C/min do 230°C oraz utrzymanie stałej temperatury przez 5 minut. Gazem nośnym był hel, w ilości 1,0 cm³/min w ciągłym przepływie. Prąd jonizacji wynosił 70 eV, a temperatura źródła jonów 250°C. Detektor ustawiono na skanowanie od m/z=40 do m/z=400. Związki zostały zidentyfikowane przy użyciu bibliotek widm masowych oraz bazy NIST (http://webbook.nist.gov/chemistry/).

Rysunek 17. Chromatograf gazowy Clarus 580

●  Oznaczenie związków goryczkowych w brzeczce i piwie

• Oznaczenie goryczki brzeczkiGorycz brzeczki oznaczano zgodnie z metodyką EBC 8.8.Brzeczki przeznaczone do analizy poddano dwukrotnemu wirowaniu przez 10 min przy 4000 obr./min. Do kolb Erlenmeyera ze szlifem o pojemności 50 cm³ odmierzono pipetą po 5 ml odwirowanej brzeczki, dodano 5 ml wody, 0,5 ml HCl i 20 ml izooktanu. Następnie do kolb dodano dwie szklane kulki, szczelnie zakręcono i wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej Shaker S 50 przez 15 min, utrzymując temperaturę 20°C. Po tym czasie zmierzono absorbancję warstwy izooktanowej przy długości fal 275 nm przy użyciu kuwety kwarcowej o grubości 10 mm. Pomiar zerowy stanowił czysty izooktan.

• Oznaczenie goryczki piwaPiwa przeznaczone do analizy doprowadzono do temperatury 20°C i odgazowano przez wytrząsanie w wytrząsarce z łaźnią wodną. Następnie poddano wirowaniu przez 10 min przy 4000 obr./min. Do kolb Erlenmeyera ze szlifem o pojemności 50 cm³ odmierzono pipetą po 10 ml odgazowanego i odwirowanego piwa, dodano 0,5 ml HCl i 20 ml izooktanu. Następnie do kolb dodano dwie szklane kulki, szczelnie zakręcono i wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej Shaker S 50 przez 15 min, utrzymując temperaturę 20°C. Po tym czasie zmierzono absorbancję warstwy izooktanowej przy długości fali 275 nm przy użyciu kuwety kwarcowej o grubości 10 mm. Pomiar zerowy stanowił czysty izooktan.

●  Oznaczenie ogólnej zawartości polifenoli metodą Swain i Hills.

Sporządzenie krzywej wzorcowej:

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml dodano kolejno 1; 2; 5; 10; 15; 20; 25 ml standardowego roztworu katechiny ((+)-katechiny, Sigma- stężenie roztworu 50 mg/100 cm³ metanolu) i dopełniono metanolem do kreski miarowej. Następnie z każdej kolby pobrano 0,5 ml roztworu do probówek na 12 ml i dodano 4,5 ml wody. Kolejno dodano 0,25 ml odczynnika Folina – Ciocalteau (rozcieńczonego wcześniej wodą redestylowaną w stosunku 1:1 V/V) oraz 0,5 ml 7% roztworu Na₂CO₃. Zamieszano i pozostawiono w ciemności na 30 min. Po tym czasie zmierzono absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm. Pomiar zerowy wykonano przy użyciu metanolu.

Przygotowanie prób właściwych:

• Próbki piwa odgazowano przez wytrząsanie.
• Próbki brzeczek wirowano dwukrotnie przez 10 min przy 4000 obr./min

Wszystkie próbki rozcieńczono 2 i 5x wodą destylowaną. Z tak przygotowanych roztworów odmierzano 5 ml do probówek na 12 ml. Później dodawano kolejno 0,25 ml odczynnika Folina – Ciocalteau (rozcieńczonego wcześniej wodą redestylowaną w stosunku 1:1 V/V) oraz 0,5 ml 7% roztworu Na₂CO₃. Zamieszano i pozostawiono w ciemności na 30 min. Po tym czasie zmierzono absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 760 nm.

Zawartość polifenoli odczytano z krzywej wzorcowej.

[1] EBC- Analytica 3.6.3 Germinative Energy of Barley: Schonfeld Method

[2] EBC – Analytica 3.2 Moisture Content.

[3] EBC- Analytica 3.4 Thousand Corn Weight

[4] EBC-Analytica 3.11.1 Sieving Test

[5] EBC-Analytica 8.5 Colour of Wort: Spectrophotometric Method (IM)

[6] Analytica 8.17 pH of Wort.

[7] EBC-Analytica 9.2.1 Alcohol in Beer by Distillation

[8] EBC-Analytica 8.10 Free Amino Nitrogen in Beer by Spectrophotometry (IM)